История одного эксперимента: начало

[imbg]

 Очень интересно: у меня есть один белок - для простоты просто назову его имя: IkB-alpha - известный ингибитор воспаления в клетках. Он класически деградирует после 10-15 минут стимуляции под ноль, и снова нарабатывается через час (такая себе обратная связь - воспалительный сигнал сам себя выключает, чтоб не вызвать гипервоспаления). Схема процесса показана на рисунке, но в ней разбираться не стоит - речь о другом.


Как умею, так и подписал :). А оригинально картинка на Wiki висит.

Я экспрессирую этот белок с меткой из нескольких аминокислот (Flag): при чем сначала делал оверэкспрессию, потом уменьшал дозу посредством уменьшения количества плазмиды (до 100 раз меньше); потом вводил уже этот ген в составе вируса (единичная копия на клетку под слабым промотором) - и все равно получаю один и тот же результат: при стимуляции внутриклеточный деградирует как написано в учебниках, а идентичный ему белок, внесенный мною, остается целехонький.

Сиквенс показал, что белки идентичны. Сначала думали - дело в количестве белка. Но даже при концентрациях, идентичным физиологическим, белок не деградировал. Мы выдвинули версию - единственное различие - это то, что в плазмиде отсутствует его родная 3'-UTR область. А я где-то читал, что 3'-UTR важна для транспортировки белков в нужное место метаболома. Как вы думаете? Если правда, то тогда как проверить?

Comments

[marina-fr.livejournal.com]

А влияние miR проверяли?

[imbg.livejournal.com]

Ну мы этим пока не делали - все равно сейчас клонируем новый конструкт с UTR, на нем заодно и миРНК проверим. Но по сегодняшним данным, белок наработан всегда - а уничтожается только после сигнала путем убиквитинилирования через протеосому

[anton nikolaev (from livejournal.com)]

А пробовали flag эпитоп передвинуть? Скажем в другой конец белка? Может он как нить меняет конформацию вашего белка, что он становится недоступным для какого нибудь взаимодействия...

[imbg.livejournal.com]

Мы думаем об этом, как раз сейчас запускаем С-терминальную метку. Через пару дней расскажу :). Но все-таки мне охото привязать все к отличиям в мРНК структуре.

[anton nikolaev (from livejournal.com)]

Я вас понимаю :)

[imbg.livejournal.com]

Пару дней растянулись. Наконец клонинги закончены, и опыт повторен дважды - ни N-, ни С-терминальная метка не влияла на ситуацию. Правда мы обнаружили, что белок все-таки деградирует - но намного медленнее и с большой задержкой (можно предположить, что после истощения эндогенного доходит очередь и до нашего).
теперь с чистым сердцем переходим к клонированию 3-UTR.

[anton nikolaev (from livejournal.com)]

Не теряйте времени на шампанское, вас ожидает интересный Новый Год! :)

[(Anonymous)]

Будет черезвычайно интересно дождаться результатов с 3'-UTR

[imbg.livejournal.com]

Я обязательно проинформирую о результатах - дело в том, что я вынашиваю эту идею уже года три, и наконец удалось убедить шефа заняться этим (для этого пришлось сначала шефа поменять).