Мистика

Я очень люблю истории про то, как по какому-то неизвестному принципу с молекулами происходят разные таинственные вещи. Часто оказывается, что молекулы иногда могут восстанавливать сами себя - так было открыто например РНК-редактирование, а еще раньше - репарация повреждений генома.

Однако одно дело - когда такое происходит где-то там, а совсем другое - когда это случается прямо в твоих руках.


фото отсюда

Есть такие короткие РНК - shRNA -  предшественники сиРНК (siRNA). Их функция - подавление экспрессии определенных генов (подробнее мы писали о них в статье "Обо всех РНК на свете, больших и малых"). shRNA обычно делают искусственно - заказывают два длинных праймера (около 50 нуклеотидов), которые на 80% комплементрарны друг другу. Такие праймеры клонируют в плазмиду, и после трансфекции в клетках нарабатывается siRNA против интересующего вас гена. Типичный протокол можна найти по ссылке (Addgene).

Обычно олигонуклеотиды для shRNA выглядят вот так:

Forward: 
5' CCGGAATGCCTACGTTAAGCTATACCTCGAGGTATAGCTTAACGTAGGCATTTTTTTG 3'

Reverse: 
5' AATTCAAAAAAATGCCTACGTTAAGCTATACCTCGAGGTATAGCTTAACGTAGGCATT 3'

Жирным выделены комплементарные последовательности, которые впоследствии дадут саму siRNA, а обычным шрифтом - промежуточные вставки, которые содержат сайты рестрикции - два концевых для вставки в плазмиду, и один в центре (синий, XhoI) - для последующего скрининга колоний. С центральным сайтом как раз и приключилось мистическое приключение.

Попросив студента заказать аналогичные праймеры для нашего белка, я обнаружил (уже когда заказ пришел), что он допустил ошибку - в центральном сайте вместо ...CTCGAG... он внес ...CTCGCG... (как такое можно сделать при работе с кнопками Ctrl+C и Ctrl+V - не представляю, но поскольку сам был когда-то студентом, то в принципе верю. что такое возможно). В результате сайт XhoI исчез.

Но делать нечего - праймеры пришли, и мы решили клонировать их, а отбор позитивных клонов провести не рестрикцией, а с помощью ПЦР.  Отобрали три колонии, выделили плазмиды и отправили на сиквенс.

Сиквенс показал, что все три плазмиды позитивны, и (!) содержат правильную последовательность: т.е. ...CTCGAG... (как было задуманно в методике), а не  ...CTCGCG.. (как мы заказали по ошибке!) 

 Чтоб оценить степень мистики, давайте я кратко просуммирую:

1. Праймеры были заказали с одной мутацией - вместо А был заказан С. Я заново поднял формы заказа - так и есть, заказ ушел с ошибкой.

2. Мутация, внесенная нами, не выглядит серьезной настолько, чтоб по ней мог пройти негативный отбор. Этот центральный сайт нужен для удобства клонинга, и не дает каких-либо преимуществ. Т.е. никаких преимуществ для роста бактерии (речь про клонинг) ни тот, ни другой вариант плазмиды вряд ли может дать.

3. Из трех отвсеквенированных плазмид две несли в себе правильный нуклеотид, в третьей это место не прочиталось (на хроматограмме было 50/50 А против С). Вряд ли это ошибка при сиквенсе.

Вывод: или на фирме какой-то студент слычайно внес обратную мутацию в сиквенс заказа; либо бактерии читали протокол и решили слегка помочь; либо это чистая мистика. 

А какие предложения у вас?
 

Мистика - продолжение и окончание

 Поскольку любые полтергейсты не приемлемы политикой нашей ЖЖ-странички, редакция блога imbg , отложив все дела, искала любые материалистические объяснения необъяснимых игр природы (см.предыдущий пост).

Напомним - при клонировании праймера с ошибкой мы получили плазмиду с корректным сиквенсом - значит на каком-то этапе праймер либо подменили, либо спонтанная обратная мутация в некоторых праймерах дала им значительные преимущества перед мутантными формами, ошибочно заказанными нами. Для ясности назовем правильные праймеры диким типом, или wt (те, которые надо было заказать); праймеры с точечной мутацией, которые мы по ошибке заказали - мутантным праймером.

С помощью программы Vector NTI 11 мы сравнили способность образовывать шпильки wt-праймера (нижнее окно, синяя обводка), и мутантного праймера (верхнее окно, красная обводка). 

\
Получено с помощью програмы Vector NTI 11
Верхняя таблица - анализ wt-праймера; нижняя таблица - анализ мутантного праймера

Что мы видим - замена одного нуклеотида резко увеличивает вероятность образования стабильной шпильки по всей длинне мутантного праймера (собственно. это логично, потому что праймер состоит из двух комплементарных последовательностей). Энергетические показатели этой шпильки говорят о том, что в нормальных условиях расплести ее не легко ( -33 kkal/mol против ~2 kkal/mol, характерных для шпилек, образованных праймерами с нормальным сиквенсом). В случае wt-праймера - вероятно наличие в центре аденина (А) нарушает структуру шпильки и не дает ей схлопнуться самой на себя.

Из этого вытекает приемлемое для меня объяснение мистических проишествий, проишедших в моей лаборатории на прошлой неделе.

Допустим, автоматический синтезатор олигонуклеотидо допускает ошибку порядка 0.1% на 1 нуклеотид (если кто-то знает более точные и достоверные данные, пишите в комментарии).
Во время клонинга, мы смешали смесь праймеров с плазмидой. 99.9% праймеров (с мутацией) в мягких условиях реакции лигирования скрутились в шпильку, которая замкнулась "сама на себя". Возможно, из-за суперскрученности концы праймеров спрятались, и лигировать их с плазмидой не представлялось возможным. В то же время некоторое количество праймеров, в которых по тем или иным причинам произошла обратная мутация, жестких шпилек не образовывали, и легко клонировались в плазмиду. Последующая трансформация в E.coli увеличила количество "обратных ревертантов", и в результате я получил чудесным образом отредактированные вставки в плазмиде. Все счастливы, а  главное - никакой мистики!

P.S. Критику по существу с благодарностью приму в комментариях.

(Начало мистической истории)