История одного эксперимента: начало
Dec. 14th, 2010 10:31 am![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
imbg Очень интересно: у меня есть один белок - для простоты просто назову его имя: IkB-alpha - известный ингибитор воспаления в клетках. Он класически деградирует после 10-15 минут стимуляции под ноль, и снова нарабатывается через час (такая себе обратная связь - воспалительный сигнал сам себя выключает, чтоб не вызвать гипервоспаления). Схема процесса показана на рисунке, но в ней разбираться не стоит - речь о другом.
Как умею, так и подписал :). А оригинально картинка на Wiki висит.
Я экспрессирую этот белок с меткой из нескольких аминокислот (Flag): при чем сначала делал оверэкспрессию, потом уменьшал дозу посредством уменьшения количества плазмиды (до 100 раз меньше); потом вводил уже этот ген в составе вируса (единичная копия на клетку под слабым промотором) - и все равно получаю один и тот же результат: при стимуляции внутриклеточный деградирует как написано в учебниках, а идентичный ему белок, внесенный мною, остается целехонький.
Сиквенс показал, что белки идентичны. Сначала думали - дело в количестве белка. Но даже при концентрациях, идентичным физиологическим, белок не деградировал. Мы выдвинули версию - единственное различие - это то, что в плазмиде отсутствует его родная 3'-UTR область. А я где-то читал, что 3'-UTR важна для транспортировки белков в нужное место метаболома. Как вы думаете? Если правда, то тогда как проверить?
Как умею, так и подписал :). А оригинально картинка на Wiki висит.
Я экспрессирую этот белок с меткой из нескольких аминокислот (Flag): при чем сначала делал оверэкспрессию, потом уменьшал дозу посредством уменьшения количества плазмиды (до 100 раз меньше); потом вводил уже этот ген в составе вируса (единичная копия на клетку под слабым промотором) - и все равно получаю один и тот же результат: при стимуляции внутриклеточный деградирует как написано в учебниках, а идентичный ему белок, внесенный мною, остается целехонький.
Сиквенс показал, что белки идентичны. Сначала думали - дело в количестве белка. Но даже при концентрациях, идентичным физиологическим, белок не деградировал. Мы выдвинули версию - единственное различие - это то, что в плазмиде отсутствует его родная 3'-UTR область. А я где-то читал, что 3'-UTR важна для транспортировки белков в нужное место метаболома. Как вы думаете? Если правда, то тогда как проверить?
