![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
imbgЯ очень люблю истории про то, как по какому-то неизвестному принципу с молекулами происходят разные таинственные вещи. Часто оказывается, что молекулы иногда могут восстанавливать сами себя - так было открыто например РНК-редактирование, а еще раньше - репарация повреждений генома.
Однако одно дело - когда такое происходит где-то там, а совсем другое - когда это случается прямо в твоих руках.
фото отсюда
Есть такие короткие РНК - shRNA - предшественники сиРНК (siRNA). Их функция - подавление экспрессии определенных генов (подробнее мы писали о них в статье "Обо всех РНК на свете, больших и малых"). shRNA обычно делают искусственно - заказывают два длинных праймера (около 50 нуклеотидов), которые на 80% комплементрарны друг другу. Такие праймеры клонируют в плазмиду, и после трансфекции в клетках нарабатывается siRNA против интересующего вас гена. Типичный протокол можна найти по ссылке (Addgene).
Обычно олигонуклеотиды для shRNA выглядят вот так:
Forward:
5' CCGGAATGCCTACGTTAAGCTATACCTCGAGGTATAGCTTAACGTAGGCATTTTTTTG 3'
Reverse:
5' AATTCAAAAAAATGCCTACGTTAAGCTATACCTCGAGGTATAGCTTAACGTAGGCATT 3'
Жирным выделены комплементарные последовательности, которые впоследствии дадут саму siRNA, а обычным шрифтом - промежуточные вставки, которые содержат сайты рестрикции - два концевых для вставки в плазмиду, и один в центре (синий, XhoI) - для последующего скрининга колоний. С центральным сайтом как раз и приключилось мистическое приключение.
Попросив студента заказать аналогичные праймеры для нашего белка, я обнаружил (уже когда заказ пришел), что он допустил ошибку - в центральном сайте вместо ...CTCGAG... он внес ...CTCGCG... (как такое можно сделать при работе с кнопками Ctrl+C и Ctrl+V - не представляю, но поскольку сам был когда-то студентом, то в принципе верю. что такое возможно). В результате сайт XhoI исчез.
Но делать нечего - праймеры пришли, и мы решили клонировать их, а отбор позитивных клонов провести не рестрикцией, а с помощью ПЦР. Отобрали три колонии, выделили плазмиды и отправили на сиквенс.
Сиквенс показал, что все три плазмиды позитивны, и (!) содержат правильную последовательность: т.е. ...CTCGAG... (как было задуманно в методике), а не ...CTCGCG.. (как мы заказали по ошибке!)
Чтоб оценить степень мистики, давайте я кратко просуммирую:
1. Праймеры были заказали с одной мутацией - вместо А был заказан С. Я заново поднял формы заказа - так и есть, заказ ушел с ошибкой.
2. Мутация, внесенная нами, не выглядит серьезной настолько, чтоб по ней мог пройти негативный отбор. Этот центральный сайт нужен для удобства клонинга, и не дает каких-либо преимуществ. Т.е. никаких преимуществ для роста бактерии (речь про клонинг) ни тот, ни другой вариант плазмиды вряд ли может дать.
3. Из трех отвсеквенированных плазмид две несли в себе правильный нуклеотид, в третьей это место не прочиталось (на хроматограмме было 50/50 А против С). Вряд ли это ошибка при сиквенсе.
Вывод: или на фирме какой-то студент слычайно внес обратную мутацию в сиквенс заказа; либо бактерии читали протокол и решили слегка помочь; либо это чистая мистика.
А какие предложения у вас?
Однако одно дело - когда такое происходит где-то там, а совсем другое - когда это случается прямо в твоих руках.
фото отсюда
Есть такие короткие РНК - shRNA - предшественники сиРНК (siRNA). Их функция - подавление экспрессии определенных генов (подробнее мы писали о них в статье "Обо всех РНК на свете, больших и малых"). shRNA обычно делают искусственно - заказывают два длинных праймера (около 50 нуклеотидов), которые на 80% комплементрарны друг другу. Такие праймеры клонируют в плазмиду, и после трансфекции в клетках нарабатывается siRNA против интересующего вас гена. Типичный протокол можна найти по ссылке (Addgene).
Обычно олигонуклеотиды для shRNA выглядят вот так:
Forward:
5' CCGGAATGCCTACGTTAAGCTATACCTCGAGGTATAGCTTAACGTAGGCATTTTTTTG 3'
Reverse:
5' AATTCAAAAAAATGCCTACGTTAAGCTATACCTCGAGGTATAGCTTAACGTAGGCATT 3'
Жирным выделены комплементарные последовательности, которые впоследствии дадут саму siRNA, а обычным шрифтом - промежуточные вставки, которые содержат сайты рестрикции - два концевых для вставки в плазмиду, и один в центре (синий, XhoI) - для последующего скрининга колоний. С центральным сайтом как раз и приключилось мистическое приключение.
Попросив студента заказать аналогичные праймеры для нашего белка, я обнаружил (уже когда заказ пришел), что он допустил ошибку - в центральном сайте вместо ...CTCGAG... он внес ...CTCGCG... (как такое можно сделать при работе с кнопками Ctrl+C и Ctrl+V - не представляю, но поскольку сам был когда-то студентом, то в принципе верю. что такое возможно). В результате сайт XhoI исчез.
Но делать нечего - праймеры пришли, и мы решили клонировать их, а отбор позитивных клонов провести не рестрикцией, а с помощью ПЦР. Отобрали три колонии, выделили плазмиды и отправили на сиквенс.
Сиквенс показал, что все три плазмиды позитивны, и (!) содержат правильную последовательность: т.е. ...CTCGAG... (как было задуманно в методике), а не ...CTCGCG.. (как мы заказали по ошибке!)
Чтоб оценить степень мистики, давайте я кратко просуммирую:
1. Праймеры были заказали с одной мутацией - вместо А был заказан С. Я заново поднял формы заказа - так и есть, заказ ушел с ошибкой.
2. Мутация, внесенная нами, не выглядит серьезной настолько, чтоб по ней мог пройти негативный отбор. Этот центральный сайт нужен для удобства клонинга, и не дает каких-либо преимуществ. Т.е. никаких преимуществ для роста бактерии (речь про клонинг) ни тот, ни другой вариант плазмиды вряд ли может дать.
3. Из трех отвсеквенированных плазмид две несли в себе правильный нуклеотид, в третьей это место не прочиталось (на хроматограмме было 50/50 А против С). Вряд ли это ошибка при сиквенсе.
Вывод: или на фирме какой-то студент слычайно внес обратную мутацию в сиквенс заказа; либо бактерии читали протокол и решили слегка помочь; либо это чистая мистика.
А какие предложения у вас?
самокоррекция
Date: 2010-11-24 12:32 pm (UTC)ozhigov@cs.msu.su
web://qi.cs.msu.su