Красота спасет мир...

[imbg]

 Но конкретно одну из моих идей красота закопала на корню.

Один белок, который я изучаю, вдруг при ряде анализов (масс-спект) показал интеракцию в целым рядом митохондриальных белков. Изучаемый белок, хоть и мало изучен, никаких митохондриальных сигналов на себе не несет, и что он может делать в митохондрии - совсем не ясно. Но все-таки много косвенных данных подтверждали результаты спектроскопии - белок очень может иметь какие-то неизвестные функции в мито.

Простейший путь перепроверить - это посмотреть, пересекается ли меченный белок (зеленый, GFP) с митохондриями (Mitotracker, красный) под конфокальным микроскопом. Я этот метод люблю за неземную красоту получаемых результатов. Результат и правда безумно  красив:







Вывод - зеленый белка не пересекается с красным, а значит он и не присутствует в митохондрии. А значит, о фантазиях на тему открытия можно забыть.

А жаль. 

Comments

[zloradskij.livejournal.com]

а синее - это что?

[imbg.livejournal.com]

ядро - для контроля

[phago-lov.livejournal.com]

DAPI или Hoechst?

[imbg.livejournal.com]

Hoechst 33342

[phago-lov.livejournal.com]

А колокализацию, кроме как визуально, как-то замерить не пытался? Судя по картинкам - не так всё однозначно оказаться может. Ко всему, я бы сигнал митотрекера снизил, по-моему, он у тебя слекга фонит.

[imbg.livejournal.com]

оно получается вроде как парит над митохондриями - т.е. план Б, запасной - потому что второй большой сет белков, с ним взаимодействующих - белки везикулярного транспорта - экзоцитоза и эндоцитоза.

[phago-lov.livejournal.com]

Я бы пару сотен срезов сделал в разных проекциях, а потом запустил как слайд-шоу. Визуально много более информативно. Не говоря про количественно обработать. Тогда уже можно будет говорить уверенно.

[imbg.livejournal.com]

так сделано - просто тут же не постить мультик, лень да и ни к чему :)
Мой вывод как раз на z-stacks; правда там не пара сотен, а два десятка срезов, но вполне хватает, чтоб четко сказать - они на разных уровнях.

[phago-lov.livejournal.com]

Ну, тады ой. ))

[superhimik.livejournal.com]

А что такое "конфокальный микроскоп"?

[imbg.livejournal.com]

Конфокальный микроскоп — оптический микроскоп, обладающий значительным контрастом по сравнению с обычным микроскопом, что достигается использованием апертуры, размещённой в плоскости изображения и ограничивающей поток фонового рассеянного света. (вики)
Я не знаю физику этого аппарата, но для возбуждения флуорисцентных меток там используются лазеры (всего набор из четырех лазеров разной длинны у нас, может естьи другие). Плюс серьезная прокси под обработку картинок. В результате ты одновременно можешь смотреть четыре разных света (четыре разных метки), при чем намного ярче и "регулируемее" - притушить синий и усилить красный, поднять яркость и zoom - это все делается играючи под каждую фотографию. Но это не главное.
Главное качество - микроскоп "нарезает" препарат заданными ломтиками "вдоль" - у меня например ширина слоя, который на картинках - 1 мкм. Как это достигается - я не представляю, но это именно и необходимо для выявления колокализации: потому что только так ты уверен, что твой белок в ядре (в митохондрии и т.п.), а не над или под ней. Попробовал показать на картинке смысл "нарезки" - рис.1 (еще раз, я не представляю физику этого процесса. и буду рад, если кто-то добавит объяснения понятным языком):
 


Ну и рис. 2 и 3 показывает именно колаколизационный эксперимент - есть меченный зеленым белок, который не находится в ядре. Световой микроскоп не может показать это с увереностью; конфокальный именно такие задачи решает на "5" за пол-часа.

[superhimik.livejournal.com]

Ага. Физику, честно говоря, и я не понял. Но по картинкам фишку просёк.

Вопрос № 2. А почему за "почаса"? Это ж многовато как-то.

[imbg.livejournal.com]

Полчаса.
Ну, это включить, прогреть, посмотреть, выключить. Одна картинка на настроенном и готовом к работе микроскопе делается от 1 до 5 минут - в зависимости от желаемого качества

[superhimik.livejournal.com]

А-а-а.