Мистика - продолжение и окончание

[imbg]

 Поскольку любые полтергейсты не приемлемы политикой нашей ЖЖ-странички, редакция блога imbg , отложив все дела, искала любые материалистические объяснения необъяснимых игр природы (см.предыдущий пост).

Напомним - при клонировании праймера с ошибкой мы получили плазмиду с корректным сиквенсом - значит на каком-то этапе праймер либо подменили, либо спонтанная обратная мутация в некоторых праймерах дала им значительные преимущества перед мутантными формами, ошибочно заказанными нами. Для ясности назовем правильные праймеры диким типом, или wt (те, которые надо было заказать); праймеры с точечной мутацией, которые мы по ошибке заказали - мутантным праймером.

С помощью программы Vector NTI 11 мы сравнили способность образовывать шпильки wt-праймера (нижнее окно, синяя обводка), и мутантного праймера (верхнее окно, красная обводка). 

\
Получено с помощью програмы Vector NTI 11
Верхняя таблица - анализ wt-праймера; нижняя таблица - анализ мутантного праймера

Что мы видим - замена одного нуклеотида резко увеличивает вероятность образования стабильной шпильки по всей длинне мутантного праймера (собственно. это логично, потому что праймер состоит из двух комплементарных последовательностей). Энергетические показатели этой шпильки говорят о том, что в нормальных условиях расплести ее не легко ( -33 kkal/mol против ~2 kkal/mol, характерных для шпилек, образованных праймерами с нормальным сиквенсом). В случае wt-праймера - вероятно наличие в центре аденина (А) нарушает структуру шпильки и не дает ей схлопнуться самой на себя.

Из этого вытекает приемлемое для меня объяснение мистических проишествий, проишедших в моей лаборатории на прошлой неделе.

Допустим, автоматический синтезатор олигонуклеотидо допускает ошибку порядка 0.1% на 1 нуклеотид (если кто-то знает более точные и достоверные данные, пишите в комментарии).
Во время клонинга, мы смешали смесь праймеров с плазмидой. 99.9% праймеров (с мутацией) в мягких условиях реакции лигирования скрутились в шпильку, которая замкнулась "сама на себя". Возможно, из-за суперскрученности концы праймеров спрятались, и лигировать их с плазмидой не представлялось возможным. В то же время некоторое количество праймеров, в которых по тем или иным причинам произошла обратная мутация, жестких шпилек не образовывали, и легко клонировались в плазмиду. Последующая трансформация в E.coli увеличила количество "обратных ревертантов", и в результате я получил чудесным образом отредактированные вставки в плазмиде. Все счастливы, а  главное - никакой мистики!

P.S. Критику по существу с благодарностью приму в комментариях.

(Начало мистической истории)

Comments

[staerum.livejournal.com]

Да, вы меня правильно поняли.
Всего 50 позиций, 4 варианта. 200 расчетов. Расчет там долгий?

Из ваших рассуждений, кажется, следует, что ни у одной из элементарных ошибок не должно быть приоритета. По логике рассуждений так должно выходить?

[imbg.livejournal.com]

Я попробую объяснить, чтоб самому понять, о чем я :)
У неас есть два плеча, которые комплементарны друг другу. Два плеча соединены спейсером в 6 нуклеотидов, которые и дают или не дают ему схлопываться. Остальные нуклеотиды не столь важны, потому что единичные замены в середине комплементарной области не смогут значительно уменьшить энергию связывания.
т.е. можно свести количество мутантов к 6х4 = 20: только нуклеотиды спейсера. Чем я сейччас и займусь.

[staerum.livejournal.com]

Кажется, мы друг друга поняли. :)