Мистика - продолжение и окончание
Nov. 22nd, 2010 07:53 pm![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
imbg Поскольку любые полтергейсты не приемлемы политикой нашей ЖЖ-странички, редакция блога ![[livejournal.com profile]](https://www.dreamwidth.org/img/external/lj-userinfo.gif)
imbg , отложив все дела, искала любые материалистические объяснения необъяснимых игр природы (см.предыдущий пост).
Напомним - при клонировании праймера с ошибкой мы получили плазмиду с корректным сиквенсом - значит на каком-то этапе праймер либо подменили, либо спонтанная обратная мутация в некоторых праймерах дала им значительные преимущества перед мутантными формами, ошибочно заказанными нами. Для ясности назовем правильные праймеры диким типом, или wt (те, которые надо было заказать); праймеры с точечной мутацией, которые мы по ошибке заказали - мутантным праймером.
С помощью программы Vector NTI 11 мы сравнили способность образовывать шпильки wt-праймера (нижнее окно, синяя обводка), и мутантного праймера (верхнее окно, красная обводка).
\
Получено с помощью програмы Vector NTI 11
Верхняя таблица - анализ wt-праймера; нижняя таблица - анализ мутантного праймера
Что мы видим - замена одного нуклеотида резко увеличивает вероятность образования стабильной шпильки по всей длинне мутантного праймера (собственно. это логично, потому что праймер состоит из двух комплементарных последовательностей). Энергетические показатели этой шпильки говорят о том, что в нормальных условиях расплести ее не легко ( -33 kkal/mol против ~2 kkal/mol, характерных для шпилек, образованных праймерами с нормальным сиквенсом). В случае wt-праймера - вероятно наличие в центре аденина (А) нарушает структуру шпильки и не дает ей схлопнуться самой на себя.
Из этого вытекает приемлемое для меня объяснение мистических проишествий, проишедших в моей лаборатории на прошлой неделе.
Допустим, автоматический синтезатор олигонуклеотидо допускает ошибку порядка 0.1% на 1 нуклеотид (если кто-то знает более точные и достоверные данные, пишите в комментарии).
Во время клонинга, мы смешали смесь праймеров с плазмидой. 99.9% праймеров (с мутацией) в мягких условиях реакции лигирования скрутились в шпильку, которая замкнулась "сама на себя". Возможно, из-за суперскрученности концы праймеров спрятались, и лигировать их с плазмидой не представлялось возможным. В то же время некоторое количество праймеров, в которых по тем или иным причинам произошла обратная мутация, жестких шпилек не образовывали, и легко клонировались в плазмиду. Последующая трансформация в E.coli увеличила количество "обратных ревертантов", и в результате я получил чудесным образом отредактированные вставки в плазмиде. Все счастливы, а главное - никакой мистики!
P.S. Критику по существу с благодарностью приму в комментариях.
(Начало мистической истории)
imbg , отложив все дела, искала любые материалистические объяснения необъяснимых игр природы (см.предыдущий пост).Напомним - при клонировании праймера с ошибкой мы получили плазмиду с корректным сиквенсом - значит на каком-то этапе праймер либо подменили, либо спонтанная обратная мутация в некоторых праймерах дала им значительные преимущества перед мутантными формами, ошибочно заказанными нами. Для ясности назовем правильные праймеры диким типом, или wt (те, которые надо было заказать); праймеры с точечной мутацией, которые мы по ошибке заказали - мутантным праймером.
С помощью программы Vector NTI 11 мы сравнили способность образовывать шпильки wt-праймера (нижнее окно, синяя обводка), и мутантного праймера (верхнее окно, красная обводка).
\Получено с помощью програмы Vector NTI 11
Верхняя таблица - анализ wt-праймера; нижняя таблица - анализ мутантного праймера
Что мы видим - замена одного нуклеотида резко увеличивает вероятность образования стабильной шпильки по всей длинне мутантного праймера (собственно. это логично, потому что праймер состоит из двух комплементарных последовательностей). Энергетические показатели этой шпильки говорят о том, что в нормальных условиях расплести ее не легко ( -33 kkal/mol против ~2 kkal/mol, характерных для шпилек, образованных праймерами с нормальным сиквенсом). В случае wt-праймера - вероятно наличие в центре аденина (А) нарушает структуру шпильки и не дает ей схлопнуться самой на себя.
Из этого вытекает приемлемое для меня объяснение мистических проишествий, проишедших в моей лаборатории на прошлой неделе.
Допустим, автоматический синтезатор олигонуклеотидо допускает ошибку порядка 0.1% на 1 нуклеотид (если кто-то знает более точные и достоверные данные, пишите в комментарии).
Во время клонинга, мы смешали смесь праймеров с плазмидой. 99.9% праймеров (с мутацией) в мягких условиях реакции лигирования скрутились в шпильку, которая замкнулась "сама на себя". Возможно, из-за суперскрученности концы праймеров спрятались, и лигировать их с плазмидой не представлялось возможным. В то же время некоторое количество праймеров, в которых по тем или иным причинам произошла обратная мутация, жестких шпилек не образовывали, и легко клонировались в плазмиду. Последующая трансформация в E.coli увеличила количество "обратных ревертантов", и в результате я получил чудесным образом отредактированные вставки в плазмиде. Все счастливы, а главное - никакой мистики!
P.S. Критику по существу с благодарностью приму в комментариях.
(Начало мистической истории)
![[identity profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/openid.png){kind=small}
no subject
Date: 2010-11-23 01:36 pm (UTC)Если речь идет об обычных твердофазных синтезаторах, то они не ошибаются в принципе. Ошибиться может оператор, программирующий синтез. Но тогда ошибка будет во всем синтезированном нуклеотиде, и это обязательно обнаружится на стадии контроля качества.
no subject
Date: 2010-11-23 03:04 pm (UTC)Если я правильно понял методику, сравнивать по энергетическим показателям надо не конкретно нашу пару, а все варианты с возможными ошибочными нуклеотидами, которые могли появится, относительно мутантного праймера.
И если при этом wt действительно наименее склонен к скручиванию - рассуждения верны. Если нет - получается должна была (могла бы) сыграть другая ошибка (у которой вероятность была бы те же 0.1%).
no subject
Date: 2010-11-23 04:41 pm (UTC)no subject
Date: 2010-11-23 04:43 pm (UTC)no subject
Date: 2010-11-23 05:27 pm (UTC)Всего 50 позиций, 4 варианта. 200 расчетов. Расчет там долгий?
Из ваших рассуждений, кажется, следует, что ни у одной из элементарных ошибок не должно быть приоритета. По логике рассуждений так должно выходить?
no subject
Date: 2010-11-23 05:30 pm (UTC)no subject
Date: 2010-11-23 05:40 pm (UTC)У неас есть два плеча, которые комплементарны друг другу. Два плеча соединены спейсером в 6 нуклеотидов, которые и дают или не дают ему схлопываться. Остальные нуклеотиды не столь важны, потому что единичные замены в середине комплементарной области не смогут значительно уменьшить энергию связывания.
т.е. можно свести количество мутантов к 6х4 = 20: только нуклеотиды спейсера. Чем я сейччас и займусь.
no subject
Date: 2010-11-23 05:42 pm (UTC)Кстати, в первом комментарии fibonachi86 говорит, что такие ошибки не возможны. Я с синтезаторами лично никогда дела не имел, поэтому не могу судить.
no subject
Date: 2010-11-23 06:05 pm (UTC)no subject
Date: 2010-11-23 06:07 pm (UTC)Все же на этой, пусть чисто иллюстративной оценке построена гипотеза.
no subject
Date: 2010-11-23 06:21 pm (UTC)Т.е. если допустить возможность ошибки - то остальное можно просчитать и получить логическое объяснение. Если принять, что ошибки быть не могло, и сработало что-то другое - тогда мы возвращаемся в начало.
Но я сейчас смотрю те 20 вариантов из пердыдущего комментария - пока не нахожу аналогичных замен, которые бы "убили" праймер.
no subject
Date: 2010-11-23 06:51 pm (UTC)no subject
Date: 2010-11-23 08:34 pm (UTC)no subject
Date: 2010-11-23 10:00 pm (UTC)